埃博拉疫苗

2014-2015年西非埃博拉疫情期间，中国工程院院士陈薇率队赴非洲疫区完成埃博拉疫苗临床试验，是第一个在境外开展临床研究的中国疫苗，而后成为全球首个新基因型埃博拉疫苗。2014年11月26日，美国国家卫生研究院(NIH)宣布，美国制埃博拉疫苗已成功通过临床试验，接受疫苗的志愿者均产生了抗体，且未出现严重副作用。2016年12月23日，世界卫生组织宣布，由加拿大公共卫生局研发的疫苗可实现高效防护埃博拉病毒。这是世界上第一种可预防埃博拉出血热的疫苗，有望于2018年上市。这一疫苗通过了世卫组织领导的临床试验，近1.2万直接或间接接触过埃博拉患者的人参与了试验。

一、简介

二、研发背景

埃博拉病毒2013年开始在西非多国蔓延， 2014年9月28日，据世界卫生组织统计，超过6200人受到埃博拉病毒感染，死亡人数超过2900人。自2014年3月以来, 埃博拉病毒在西非多个国家暴发,引起全球关注,WHO已将此疫情列为国际关注的突发公共卫生事件。虽然有很多因素限制了埃博拉疫苗的发展,目前无可用于人的疫苗获批上市,但当前的严峻形式促进了疫苗的研究。

三、疫苗原理

重组水泡性口膜炎病毒VSV的表面有一个糖蛋白，作用是识别宿主细胞。这个蛋白就相当于一把钥匙，打开人体细胞那把锁之后，就可长驱直入了。

研究者对这种病毒进行了转基因，把它原有的糖蛋白用埃博拉病毒表面的糖蛋白替换。这样一来，改造之后的VSV疫苗既能让机体产生针对埃博拉病毒的抗体，同时又没有致病性。

四、疫苗种类

目前缺乏有效治疗手段，因此，研制有效预防和控制埃博拉病毒（EBOV）暴发的疫苗极为迫切。在过去20年里，有多种疫苗被研发，且在不同动物模型中研究其有效性，每种疫苗均有其独特的优点和限制性。

4.1 灭活疫苗在早期研究中，将EBOV通过福尔马林灭活或热灭活后，灭活的EBOV不能对非人灵长类提供保护。此外，通过碘萘基叠氮化物灭活病毒，可保护机体免遭致死性病毒的攻击，但如果使用γ射线灭活，就不会达到同样的保护效果，说明灭活方法可能会影响病毒蛋白的结构和免疫原性。虽然灭活疫苗可避免预存免疫和载体本身诱导的免疫反应问题，但须在4级生物安全实验室中操作活病毒，成本高，且面临安全性等问题，限制了此类疫苗的发展。

4.2 复制子疫苗委内瑞拉马脑炎病毒（Venezue－ lan equine encephalitis virus, VEEV）复制子表达 EBOV糖蛋白（GP）或核蛋白（NP）后，被用于埃博拉疫苗的研究。单独免疫表达NP的VEEV复制子可对小鼠提供完全保护，单独免疫表达 GP 的 VEEV 复制子可对豚鼠提供完全保护，将二者联合免疫，既可保护小鼠，又可保护豚鼠。但不论是单独免疫还是联合免疫，即使免疫剂量为 107 病灶形成单位（focus-forming units, FFU）也不能保护短尾猴。当免疫剂量达到 1010 FFU 时，才可保护非人灵长类。需高剂量免疫和预存免疫限制了此疫苗在人类中的应用。库京病毒，为黄病毒家族的一员，具有自我复制 RNA 能力，以此病毒为基础制备的复制子疫苗可保护25%至86%的豚鼠。此疫苗未在非人灵长类中进行评价，且虽然VEEV 复制子疫苗对豚鼠提供 100%保护，但需要高剂量才能保护非人灵长类，因此库京病毒复制子疫苗的前景不被看好。

4.3 DNA 疫苗已研究的DNA 疫苗被证明可保护小鼠和豚鼠免遭致死性 EBOV 的攻击，且可多次反复注射以增强免疫反应。已有 DNA 疫苗用于Ⅰ期临床试验，证明其安全并有免疫原性。然而，尚未在非人灵长类模型中评价 DNA疫苗的效果。

4.4 亚单位疫苗利用杆状病毒表达系统，在昆虫细胞内生产EBOV GP蛋白并纯化后，免疫豚鼠1次，或在免疫 DNA 疫苗后作为加强免疫，可诱导产生较高水平的抗体，但不能保护机体免遭病毒的攻击，且保护率与中和抗体水平间无对应关系。

病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）以其独特特点吸引研究者关注：可对免疫个体进行多次免疫；由于 VLPs 空间结构与天然病毒相似，因此诱导中和抗体的能力比可溶性抗原更强；VLPs 易被抗原提呈细胞（如树突状细胞）捕获，从而刺激机体产生抗体和细胞免疫反应；可将免疫刺激分子融合表达于 VLPs 中，用以增强免疫反应。最早的研究是将表达 GP 和 VP40 蛋白的 DNA 载体转染人293T 细胞后获得 EBOV VLPs，3 次免疫后，可保护小鼠。如果在 VLPs 中加入佐剂， 2 次免疫小鼠即可抵抗高剂量病毒的攻击，免疫 1 次就可保护豚鼠，还可保护非人灵长类，首次证明非病毒载体疫苗在非人灵长类模型中可激发保护性免疫反应。此外，也可利用昆虫细胞生产 VLPs，其形态和功能均与在哺乳动物中生产的相似，可在小鼠体内激发有效的保护反应。使用昆虫细胞生产提高了产量，大幅度降低了生产成本，且昆虫细胞更安全，但须在非人灵长类模型中验证其有效性。

4.5 复制缺陷型 EBOV 利用反向遗传技术，可对 EBOV 基因组进行改造。通过将转录激活物额外病毒结构蛋白（VP30）的基因去除，获得没有复制能力的 EBOV （rEBOVΔVP30）。将 rEBOVΔVP30 接种可稳定表达 VP30 的细胞系后，病毒可感染细胞产生子代病毒，但由于基因组缺少 VP30，因此子代病毒无感染能力，即生命周期为单周期。但由于 rEBOVΔVP30 基因组仍含有95%的 EBOV 基因组，因此对其安全性有疑虑，尤其担心在病毒传代过程中，是否会重组 VP30 用以完善自身的基因组。然而实验表明，连续传代至少7代以内，没有发现重组现象，并且以目前对丝状病毒的了解，此重组现象理论上不会发生。

4.6 病毒载体疫苗

4.6.1 重组 5 型腺病毒（adenovirus type 5, Ad5）疫苗重组Ad5疫苗是最早被研究的重组活载体疫苗，也可能是 EDV 疫苗平台中最为领先的疫苗，被证明在非人灵长类中可提供有效保护。早期研究中，对非人灵长类首次免疫可表达 EBOV GP的DNA 疫苗，再加强免疫可表达 GP 的人 Ad5疫苗，可保护机体免遭致死性 EBOV 的攻击，首次证明了通过免疫可保护非人灵长类。随后实验表明，将表达 GP和NP蛋白的重组 Ad5 混合，对非人灵长类免疫1次即可提供保护。后续实验进一步证明，单独免疫表达 GP 的重组Ad5，最低免疫剂量为 1010 噬斑形成单位即可对非人灵长类提供足够的保护。然而，由于腺病毒的预存或抗载体免疫，限制了此疫苗的发展。如果研制非注射用疫苗（如口服或滴鼻免疫）或非人类病毒载体疫苗，可能会给 Ad5 载体疫苗带来希望。对此，一种新型鼻部喷雾疫苗已被研制，该疫苗使用弱化的重组 Ad5 表达 EBOV GP 蛋白，对非人灵长类免疫后 62d能提供部分保护（67%），免疫后 150 d体内仍存在针对 GP 蛋白的 T 细胞群和抗体。下一步将进行Ⅰ期临床试验来检测这种疫苗在人类中的效果。该疫苗可刺激机体产生抗 GP 的抗体和特异性 T 细胞反应，并可对机体提供100%的保护。

4.6.2 重组水泡型口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV）疫苗通过反向遗传操作，将 EBOV GP蛋白替换VSV的G蛋白获得的重组VSV，免疫1次，即可保护小鼠、豚鼠和非人灵长类免遭病毒的攻击。在非人灵长类感染病毒后，此疫苗也可保护机体，说明其有暴露后预防治疗的可能性。

4.6.3 重组狂犬病病毒（rabies virus, RABV）疫苗将表达 GP 的重组 RABV 免疫 1次可保护部分小鼠，免疫2次可保护100%的非人灵长类。尽管重组 RABV疫苗效果比重组 VSV 低，但将表达GP 的重组 RABV 灭活后，可部分保护非人灵长类，提示可考虑将此类疫苗以灭活形式应用，这样对人类更为安全。

4.6.4 重组副粘病毒疫苗除了以弹状病毒（例如 VSV 和 RABV）为载体外，以重组副粘病毒为载体也被用于 EDV 疫苗研发。单独表达 EBOV GP 蛋白或同时表达 GP 和 NP 蛋白的重组人副流感病毒 3 型（human parainfluenza virus 3, HPIV3）免疫 1 次，可对豚鼠提供保护。但在非人灵长类中，须免疫 2 次才可提供完全保护。在人群中有针对 HPIV3 的免疫，为了避免预存免疫干扰疫苗免疫原性，通过去除 HPIV3 表面糖蛋白 F和 HN 蛋白（预存免疫抗体针对的靶标位点）的基因，制备新型重组病毒，虽复制能力下降，但免疫1次即可保护豚鼠。以新城疫病毒（newcastle disease virus, NDV）为载体也用于疫苗研发，首次免疫时使用重组 NDV，加强免疫时使用重组HPIV3，在非人灵长类中可引起良好免疫反应。然而，此种疫苗在非人灵长类中的保护性未有报道。将一种新病毒引入人类中应用是此类疫苗主要担心的问题。

4.6.5 重组巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）疫苗表达EBOV NP蛋白T细胞表位的重组 CMV 疫苗免疫小鼠后可保护小鼠免受病毒攻击。但灵长类动物体内存在CMV，且CMV有高度的宿主特异性。因此，进一步研究时，须考虑其有效性和安全性问题。

4.6.6 重组牛痘病毒（vaccinia virus, VV）疫苗表达 EBOV 蛋白的重组 VV 也可诱导机体产生保护性免疫反应。表达 EBOV GP蛋白的重组 VV 疫苗可对豚鼠提供保护，但不能保护非人灵长类，说明此疫苗还有缺陷。

主要研发方向4

1.病毒载体与埃博拉病毒保护性抗原GP蛋白重组的疫苗

如重组水泡口腔炎病毒(VSV)疫苗，其表面有一个糖蛋白，作用是识别宿主细胞。这个蛋白就相当于一把钥匙，打开人体细胞那把锁之后，就可长驱直入了。研究者对这种病毒进行了转基因，把它原有的糖蛋白用埃博拉病毒表面的糖蛋白替换。改造之后的VSV疫苗既能让机体产生针对埃博拉病毒的抗体，同时又没有致病性。

病毒载体与埃博拉病毒保护性抗原GP蛋白重组的疫苗等在灵长类动物中以诱导有效的免疫应答走在前面,而且已完成Ⅰ期临床研究,有效解决了应急需求,但它们均以活病毒为载体,存在潜在的安全性风险,距离正式批准上市仍有一段路要走。

2.病毒样颗粒疫苗(Virus-like particles,VLP)

是一类具有病毒结构,没有病毒复制能力,较减毒疫苗和以病毒为载体的疫苗更加安全的疫苗种类。以病毒样颗粒形成的疫苗抗原可有效激发免疫应答和免疫保护效果,研发病毒样颗粒疫苗已成为埃博拉疫苗发展的重要方向。

研发难点

埃博拉病毒已被列为生物安全等级4级的病毒,应用埃博拉病原体的操作受到严格的限制和规定。因此阻碍了疫苗研发及其致病机制研究。【5】且世界上拥有这种级别实验室的国家和地区本来就不多，故开展研究的难度比较大，以至于人们对于埃博拉了解得还不够深刻。常用的疫苗策略有减毒活疫苗和灭活疫苗，这两种策略在埃博拉病毒上都不适用，减毒活疫苗一旦出现病毒毒力回复，后果不堪设想，而灭活疫苗更是不可取，因为生产这种疫苗首先需要获得大量的埃博拉病毒，生产这么多病毒需要与四级生物安全同级别的工厂，而且培养这么大量的埃博拉病毒本身就是一件非常危险的事情。【1】

其他问题

目前处于Ⅰ期临床阶段的埃博拉疫苗与现上市疫苗一样,多为有针肌肉注射免疫,存在恐针感、交叉感染、断针等弊端,抗原用量大、免疫保护不全面现实问题。由此,在免疫接种策略上降低抗原用量、诱发全面免疫应答与保护及无针无痛、简便快速、安全高效已成为疫苗研发迫切解决的重大科学问题。

参考文献

【1】环球网2014年11月27日《美国宣布首个埃博拉疫苗通过临床试验，安全有效》

【2】上海医药 2017年第38卷第1期

【3】金宏丽；王化磊；郑学星；杨松涛；夏咸柱；《埃博拉病毒病疫苗研究进展》

【4】李康；周喆《抗埃博拉病毒疫苗和核酸类药物研究进展》

【5】《重组埃博拉VLP疫苗制备及免疫效果初步研究》宁夏医科大学；任天宇 2015

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