比色法

一种显色方法

比色法(colorimetry)是通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。早在公元初古希腊人就曾用五倍子溶液测定醋中的铁。1795年，俄国人也用五倍子的酒精溶液测定矿泉水中的铁。但是，比色法作为一种定量分析的方法，大约开始于19世纪30～40年代。这是利用有色物质对特定波长光的吸收特性来进行定性分析的一种方法，其原理是基于被测物质溶液的颜色或加入显色剂后生成的有色溶液的颜色，颜色深度和物质含量成正比，则根据光被有色溶液吸收的强度，即可测定溶液中物质的含量。如利用光电效应，将透过有色溶液后的光强度成正比例地变换为电流的强度来进行比色定量的方法，称为光电比色法。

定义

以生成有色化合物的显色反应为基础，比色分析对显色反应的基本要求是：反应应具有较高的灵敏度和选择性，反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定，它和显色剂的颜色差别较大。选择适当的显色反应和控制好适宜的反应条件，是比色分析的关键。

常用方法

常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯-比尔定律(A=εbc)为基础。常用的目视比色法是标准系列法，即用不同量的待测物标准溶液在完全相同的一组比色管中，先按分析步骤显色，配成颜色逐渐递变的标准色阶。试样溶液也在完全相同条件下显色，和标准色阶作比较，目视找出色泽最相近的那一份标准，由其中所含标准溶液的量，计算确定试样中待测组分的含量。

与目视比色法相比，光电比色法消除了主观误差，提高了测量准确度，而且可以通过选择滤光片来消除干扰，从而提高了选择性。但光电比色计采用钨灯光源和滤光片，只适用于可见光谱区和只能得到一定波长范围的复合光，而不是单色光束，还有其他一些局限，使它无论在测量的准确度、灵敏度和应用范围上都不如紫外-可见分光光度计。20 世纪30～60年代，是比色法发展的旺盛时期，此后就逐渐为分光光度法所代替。

常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，前者用眼睛观察，后者用光电比色计测量，两种方法都是以朗伯－比尔定律（见紫外-可见分光光度法）为基础。

目视比色法

常用的目视比色法是标准系列法，该法采用一组由质料完全相同的玻璃制成的直径相等、体积相同的比色管，按顺序加入不同量的待测组分标准溶液，再分别加入等量的显色剂及其他辅助试剂，然后稀释至一定体积，使之成为颜色逐渐递变的标准色阶。再取一定量的待测组分溶液于一支比色管中，用同样方法显色，再稀释至相同体积，将此样品显色溶液与标准色阶的各比色管进行比较，找出颜色深度最接近于样品显色溶液的那支标准比色管，如果样品溶液的颜色介于两支相邻标准比色管颜色之间，则样品溶液浓度应为两标准比色管溶液浓度的平均值。标准系列法的主要优点是设备简单和操作简便，但眼睛观察存在主观误差，准确度较低。

光电比色法

光电比色法是在光电比色计上测量一系列标准溶液的吸光度，将吸光度对浓度作图，绘制工作曲线，然后根据待测组分溶液的吸光度在工作曲线上查得其浓度或含量。光电比色计通常由光源（钨灯）、滤光片、吸收池、接收器(光电池或光电管)、检流计五部分组成（见图）。光路结构上有单光电池式和双光电池式两种：单光电池式仪器的测量结果受光源强度变化影响较大，而双光电池式仪器则避免了这种影响。

与目视比色法相比，光电比色法消除了主观误差，提高了测量准确度，而且可以通过选择滤光片和参比溶液来消除干扰，从而提高了选择性。光电比色计和紫外－可见分光光度计的光路结构非常相似，它们之间所不同的地方在于：①分光光度计采用棱镜或光栅作色散元件，因而可以得到纯度较高的单色光束。而光电比色计采用滤光片，只能得到一定波长范围的光谱带(复合光)；②紫外－可见分光光度计采用紫外和可见区的光源，即氢灯和钨灯，而光电比色计只用一种钨灯光源，因而前者适用于紫外－可见光谱区，而后者只适用于可见光谱区；③紫外－可见分光光度计可以测定待测组分的精细吸收光谱，不仅可用于定量分析，而且可以作有机化合物的定性和结构分析，而光电比色计只能作定量分析。此外，分光光度计一般都采用灵敏度高的光电倍增管作检测器，而光电比色计一般用光电池或光电管作检测器。因此，光电比色计无论在测量的准确度、灵敏度和应用范围上都不如紫外－可见分光光度计。

在20世纪30～60年代，是比色分析发展的繁盛时期，它广泛用于冶金、地质、金属材料中微量的金属和部分非金属元素的测定。随着光学仪器制造技术的发展，紫外－可见分光光度计应用日益普及，精密度较高而价格又较低的紫外－可见分光光度计已逐渐代替光电比色计，分光光度法也随之逐渐代替了比色法。

仪器

最早应用目视比色法，由于用肉眼观察颜色的深浅误差较大，以后改用光电比色计进行测定，光电比色法是利用光电池或光电管测量透过有色溶液后的光亮度，测定时需要放置滤光片，误差较大。多采用具有分光系统(单色器)及检测器的分光光度计，使测定结果准确、省时，选择性好。

比色分析表示

在比色分析中，当入射光亮度一定时，液层厚度保持不变，则测得的吸光度A与溶液的浓度c成直线关系。在实际应用时，首先选择被测物质溶液的最大吸收波长(λmax)，在最大吸收波长时进行比色，灵敏度，然后配制一系列不同浓度的标准溶液，在一定条件下进行显色，分别测定它们的吸光度，将测得的吸光度与浓度的关系作图，得到一条直线，称为标准曲线。测定未知试样时，应在与绘制标准曲线相同的条件下进行显色，测定其吸光度，从标准曲线上查得试样的浓度。

基本反应c

比色法是以生成有色化合物的显色反应为基础的，一般包括两个步骤：首先是选择适当的显色试剂与待测组分反应，形成有色化合物，然后再比较或测量有色化合物的颜色深度。比色分析对显色反应的基本要求是：

反应应具有较高的选择性，即选用的显色剂只与待测组分反应，而不与其他干扰组分反应或其他组分的干扰很小；

反应生成的有色化合物有恒定的组分和较高的稳定性；

反应生成的有色化合物有足够的灵敏度，摩尔吸光系数一般应在104以上；

反应生成的有色化合物与显色剂之间的颜色差别较大，它们的最大吸收浓度之差一般应在60纳米以上。选用的显色剂可以是一种试剂，也可以是两种不同的试剂。如果待测组分与两种不同的试剂反应生成一种有色化合物，则称为三元络合物显色反应。这类显色反应常常具有更高的灵敏度和选择性，在比色法和紫外-可见分光光度法中应用非常普遍。选择适当的显色反应，研究最合适的反应条件和消除干扰的方法是比色分析的关键问题。溶液的酸度、显色剂的用量、温度、溶剂等对显色反应都有影响。

应用

农药的比色测定有三种类型： ①农药有效成分本身带有颜色，可以直接进行比色。如敌磺钠原药为黄棕色，在波长435纳米处有最大吸收峰，但这种类型的农药较少; ②经化学反应可以生成有色化合物。如对硫磷，经碱解后形成对硝基酚而呈黄色，可在420～480纳米波长范围内测量吸光度。③引入显色基团生成有色化合物。如农药经醇、碱水解产生酚类或芳胺，可与偶氮试剂进行偶合形成有色化合物。例如氨基甲酸酯的甲萘威等，经碱解后生成α-萘酚与对硝基苯偶氮硼氟酸甲醇溶液反应，形成黄色可以在590纳米处测定吸光度。

意义

测定柿叶中总黄酮的含量

利用黄酮类化合物可与金属离子形成有色螯合物的原理，建立柿叶中总黄酮含量测定方法，并且对供试品制备方法进行选择。通过正交试验设计选取供试品制备条件，采用分光光度法，KAc-AlCl3体系与供试品中黄酮提取物反应，选择最大吸收波长，以芦丁为对照品制作标准曲线，并做方法学考察。供试品制备:提取液70%乙醇溶液，提取时间75 min，供试品与乙醇溶液的固液比为1∶50(g/mL)，用KAc-AlCl3体系比色法测定供试品柿叶中总黄酮含量为1.13%，重复性RSD=1.86%(n=6)，平均回收率为99.23%，RSD=0.27%(n=5)。KAc-AlCl3体系比色法测定柿叶中总黄酮含量的方法可行，呈色稳定，操作简便，可作为柿叶中总黄酮的含量测定方法，并可以做为快速测定方法应用于生产中对总黄酮含量的监控。

测土壤脲酶活性

土壤脲酶活性的测定有多种方法，其中靛酚蓝比色法由于测量结果精确性较高，重现性较好，应用最为广泛。但也有培养后土壤过滤液浑浊、带色、脲酶活性受底物浓度影响较大等缺点。以此方法为基础，针对过滤方式、培养时间、底物浓度及缓冲液选择等4个重要参数进行了对比试验，以期进一步改进靛酚蓝比色法的测定准确性。结果表明，培养时选择5%的底物浓度、pH10.0的硼酸盐缓冲液、培养24h后再经KCl溶液浸提过滤比色测定，其结果比传统靛酚蓝比色法高约2.46倍，改良靛酚蓝比色法的测定结果更接近土壤真实脲酶活性。

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