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碱裂解法

制备质粒DNA的方法

抽提质粒DNA常用碱裂解法，它是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时，染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中，用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤、可得到较纯的质粒DNA。碱裂解法通常有大量提取法和小量提取法，其提取原理是一样的，只需体积按一定比例扩大。

注意事项
（1）严格控制碱变性的时间，不超过5min。因为，如果质粒处于强碱性环境中的时间过长，可发生不可逆变性，导致限制性内切酶切割困难。
（2）在加入溶液Ⅲ后，要充分混匀并置冰上。如未见大量白色沉淀，说明实验失败，应立即重做。
（3）弃上清时，必须控干即除尽管内的液体，在做最后一步时，应尽量将乙醇挥发干净，因为如残留较多乙醇，以后在做酶切鉴定时，乙醇会使限制性内切酶失活。但此步的时间不宜过长，一般在10~15min，可用滤纸条小心吸净离心管壁上的乙醇液滴以节省时间。
常见问题
1．未提到质粒或质粒得率较低
（1）大肠杆菌老化
涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
（2）质粒拷贝数低
由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
（3）菌体中无质粒
有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失，因此，不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
（4）碱裂解不充分
使用过多的菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液P1、P2和P3的用量。对低拷贝数质粒，提取时，可加倍使用溶液P1、P2和P3，可能有助于增加质粒提取量和质粒质量。
（5）溶液使用不当
溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液才能使用。
（6）吸附柱过载
不同产品中吸附柱的吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率，则需调整LB培养液的体积。
（7）质粒未全部溶解
尤其是质粒较大时，洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
（8）乙醇残留
漂洗液洗涤后应离心，尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。
（9）洗脱液加入位置不正确
洗脱液应加在硅胶膜的中心部位，以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面，达到最大洗脱效率。
（10）洗脱液不合适
DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB（10mmol/L Tris·Cl，pH8.5）或水。洗脱效率取决于pH。最大洗脱效率在pH7.0~8.5间。当用水洗脱时，确保其pH在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。
（11）洗脱体积太小
洗脱体积对回收率有一定的影响。随着洗脱体积的增大，回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率，可以增大洗脱体积。
（12）洗脱时间过短
洗脱时间对回收率也会有一定的影响。洗脱时放置1min可达到较好的效果。
2．质粒纯度不高
（1）混有蛋白质
不要使用过多菌体。溶液P1、P2、P3处理并离心后，溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白质悬浮物，可再次离心去除后再进行下一步骤。
（2）混有RNA
RNaseA处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液P3之后室温放置一段时间。如果溶液P1已保存6个月以上，请在溶液P1中添加RNaseA。
（3）混有基因组DNA
加入溶液P2和P3后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于黏稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，不要超过16h。
（4）P3溶液加入时间过长
P3溶液加入后，放置时间不要太长，否则有可能会产生小片段DNA污染。
（5）含大量核酸酶的宿主菌
宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完整性，最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如DH5α和Top10。
（6）裂解时间过长
加入溶液P2后裂解时间不应超过5min。
（7）质粒的二聚体和多聚体形式
是质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出。
3．加入溶液Ⅱ后，菌液仍然呈浑浊状态，或者浑浊度没有明显的改变
这说明细菌裂解不完全，主要原因如下。
①溶液Ⅱ失效：首先看看10% SDS是否是澄清的，NaOH是否是有效的。
②可能是细菌浓度很高，适当调整增加溶液Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ的体积。
③可能是“杂菌”污染，如果菌液生长异常快，就有可能被杂菌污染。这种情况一般表现为与目的菌有相同的抗性，生长速度异常，能够提出质粒，跑胶的条带也异常的亮，但产物不是自己想要的质粒，应特别注意。
4．电泳点样孔中有亮带
质粒中污染了细菌基因组DNA，多是由于加入溶液Ⅱ后震荡过于剧烈造成细菌基因组剪切或放置时间过长等引起。因此加溶液Ⅱ后应温和震荡，绝不能涡旋震荡，并且冰浴放置时间要短于5min。
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