核酸内切酶

生物酶

核酸内切酶（endonuclease）在核酸水解酶中，为可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸的酶，与核酸外切酶相对应。从对底物的特异性来看，可分为DNaseⅠ、DNaseⅡ等分解DNA的酶；RNase、RNaseT1等分解RNA的酶。一般来说，大都不具碱基特异性，但也有诸如脾脏RNase、RNaseT1等或限制性内切酶那种能够识别并切断特定的碱基或碱基序列的酶。

简介

30多年前，当人们在对噬菌体（细菌病毒）的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶外源DNA的限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于Heamophilus influenzae的Hind II和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，将基因切割成小的基因片段。

当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代流传开来的时候，以NEB为代表的许多公司开始寻找更多的限制性内切酶。除了某些病毒以外，限制性内切酶只在原核生物中被发现。人们正在从数以千计的细菌及古细菌中寻找新的限制性内切酶。而对已测序的原核基因组数据分析表明，限制性内切酶在原核生物中普遍存在，所有自由生存的细菌和古细菌似乎都能编码限制性内切酶。

限制性内切酶的主要功能是保护细菌不受噬菌体的感染，这一观点已被人们广泛接受。它们作为微生物免疫机制的一部分行使其功能。当一个没有限制性内切酶的细菌被病毒感染时，大部分病毒颗粒都能成功地进行感染。然而一个有限制性内切酶的同种细菌被成功感染的比率显著下降。出现更多的限制性内切酶将会起到多重保护作用；而一个拥有4到5种各自独立的限制性内切酶将会使细胞坚不可摧。

上世纪80年代，科学家开始克隆并表达限制性内切酶。克隆技术由于将限制性内切酶的表达与原有细胞环境分离开来，避免了原细胞中其它内切酶的污染，从而提高了酶的纯度。此外，克隆技术提高了限制性内切酶的产量，简化了纯化过程，使得生产成本显著降低；克隆的基因很容易进行测序分析，表达出的蛋白也能进行X射线结晶分析，这使得我们对于克隆产物更加确定。

核糖核酸酶是一类广泛存在于动植物体内的核酸水解酶.其作为一种模型蛋白被普遍用于分子生物学研究,主要生理功能是控制细胞内RNA的种类与数量分布,除参与核糖核酸转录后的剪切、修饰和降解等过程外,还与某些植物的自交不亲和性、器官发生、宿主的防御机制、控制肿瘤血管生成、杀灭肿瘤细胞及抑制病毒(包括HIV-1)的复制等有关。

限制酶图

同一DNA用不同的限制酶进行切割，从而获得各种限制酶的切割位点，由此建立的位点图谱有助于对DNA的结构进行分析。

限制性核酸内切酶分析技术是病原变异、毒株鉴别、分型及了解基因结构和进行流行病学研究的有效方法，对动物检疫有很重要的实用意义，尤其对区别进出境动物及动物产品携带病毒是疫苗毒还是野毒，以及推论其是本地毒还是外来毒有很重要的意义。

作用及分类

限制性核酸内切酶(以下简称限制性酶)是一类识别双链DNA中特定核苷酸序列的DNA水解酶，以内切方式水解DNA，产生5’-P和3’-OH末端。　1952年Luria等及1953年Bertani等研究噬菌体时发现了宿主控制性现象。Arber及其同事用放射性同位素标记证明，噬菌体在新品系中的损害伴随有其DNA的降解，但宿主自己的DNA并不降解，据此他们提出了限制 - 修饰酶假说。对于一个宿主细胞，限制性酶及 DNA甲基化酶是其细胞中的一对酶，它们对DNA底物有相同的识别顺序，但有相反的生物功能，限制性酶的功能是在DNA分子内部拆卸水解，甲基化酶是修饰，DNA分子经修饰后，就可逃避限制性酶的识别，而甲基化酶只修饰宿主自身的DNA，从而避免了限制性酶对自身DNA的破坏。

限制性酶主要分为三种类型：Ⅰ型限制酶为复合功能酶，具有限制-修饰两种功能，但在 DNA链上没有固定的切割位点，一般在离切割位点1kb到几kb的地方随机切割，不产生特异性片段。Ⅲ型酶与Ⅰ型酶基本相似，不同的是Ⅲ型酶有特异性的切割位点，但这两类酶对 DNA酶切分析的意义不大，通常所说的限制性内切酶是指Ⅱ型酶，它能够识别与切割DNA链上的特定的核苷酸顺序，产生特异性的DNA片段。

2.识别序列及消化产物的末端结构限制性酶的识别序列，大部分具有双轴对称性结构或称回文序列，如EcoRI的识别序列为：

GAA

TTC

横轴

CTT

AAG

纵轴

将纵轴一侧的序列以横轴为中心旋转180°，则纵轴两侧的序列相互对称，这种结构又称为双重对称结构。大部分酶的识别序列长度为4-6个核苷酸。4核苷酸序列在DNA链中出现频率高，对一随机排列的DNA分子来说，理论值为1/44，因此4核苷酸识别序列的限制性酶在DNA链上切点多，产生片段的数目多，长度短，显示出酶的特异性较低。对于5和6核苷酸识别序列的酶，出现频率分别为1/45和1/46 ，因此，6核苷酸序列在DNA中出现频率低，酶的特异性强，而8核苷酸识别位点在DNA链中出现机率更低(1/48 )，特导性更强，可提供更长的DNA片段。一部分限制性酶具有非典型的双轴对称性序列，其回文识别序列被个或几个其他核苷酸所间隔，如BglⅠ，这种酶的特异性比识别长度相同的典型回文序列的酶略高。另外有些限制性酶(约10种，如BbVⅠ等)，其识别序列不表现为回文结构，它们降解双链DNA时，酶切点大部分不在识别序列内，而是与识别序列相距5至13个核苷酸残基不等。

限制性酶切片段的末端结构：限制性酶不但有特定的识别序列，并且任何一种酶切割 DNA链时，总是水解核苷酸3’和5’-磷酸二酯键的3’位磷酸酯键，使产物的5’端带磷酸单酯基团，而3’末端则为游离羟基。因此某一种酶的全部产物的末端具有相同的结构。根据切点序列的结构特点，产物的末端可分为粘性末端和平末端两类。粘性末端指酶切后DNA片段末端带有1-4个核苷酸残基的单链结构，而片段两端突出的单链具有互补性，突出的单链因部位的不同，又可分为5’-与3’-粘性末端两种，突出的单链带5’磷酸单酯的称5’-粘性末端，而突出的单链含3’-羟基则称3’-粘性末端。平末端指酶切后，片段为齐头末端结构。在DNA体外重组时，粘性末端是DNA连接酶的有效底物，有很高的连接效率。

影响及因素

限制性酶切反应速度与底物的性质有很大的关系，底物的单双链结构、分子的构型、DNA链中酶识别位点的数目以及位点附近的序列等都影响着酶的催化反应。共价闭合环(超螺旋构型)DNA比其相应的线性分子的酶解作用要慢，要使超螺旋构型DNA彻底降解，需要的酶量就大。对于DNA-RNA杂合双链的酶切作用，Molloy等用EcoRI等8种酶切时，结果其 DNA链可被切割，但酶用量比双链DNA大20-50倍。部分限制性酶还可切割单链DNA，如 Hae Ⅲ等。

每一种限制性酶都有自身的识别特异性，在通常酶反应条件下，特异性不会改变，但在特殊条件下，某些酶的特异性会随之改变，如当反应缓冲液的pH由7.5升高至8.5，或甘油浓度超过5%，或用Mn2+代替Mg2+时EcoRI的识别序列由原来的GAATTC变为AATT，结果是DNA链上切点数量增加，产物片段变小，因此在不合适的反应条件下，限制性酶可表现与原来特异性不同的第二活性。所以在酶切分析中，要确保酶解条件，注意底物DNA的纯度，尽可能防止酶的第二活性。

反应液中盐的浓度是至关重要的，因此要根据所使用的酶来确定盐的浓度。限制性酶对镁离子的要求并不严格，5-30mmol/L均可作用。限制性酶的用量，一般为每微克DNA 1-5单位，为保险起见以过量3-5倍为宜，但最好先作预实验。

从理论上讲，延长反应时间可以节省酶，但长时间消化受酶的稳定性、杂酶的影响等因素的制约。国产酶不宜超过1.5小时，其他酶一般也以1-2小时为宜。酶切反应的温度一般在 37℃，只有少数酶要求特殊反应温度，如TaqⅠ要求65℃。低于37℃时大部份酶仍有活性，如EcoRI在5℃仍有活性。许多酶可用热处理(65℃)10-15分钟使酶反应终止，但并非所有酶都能热终止，不能热终止的酶可用过量EDTA终止或用酚提取来终止。

操作步骤及应用

1.操作步骤以动物病毒为例说明酶切反应步骤。

(1) 病毒DNA的提取和纯化当繁殖病毒的细胞出现80%-100%的细胞病变时(CPE)，收获并冻融三次使细胞破裂释放出病毒，3 000r/min离心10分钟，吸出上清，加10% SDS至终浓度为1%，于56℃水浴作用30分钟，加等体积的饱和酚，混匀10 000r/min离心10-15分钟，取上清反复抽提至界面无蛋白质为止，取上清用乙醚去酚数次，真空除去乙醚，然后加2.5倍预冷无水乙醇，沉淀核酸，12 000r/min离心后，核酸沉淀再用70%乙醇洗涤两次，pH8.0 TE缓冲液溶解，取少量用紫外分光光度计测其含量和纯度，其余置－20℃贮存备用。

(2) 酶切反应将病毒DNA用TE溶解为大约0.5μg/μl。然后依次加入5μl 10×酶切缓冲液（50mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl pH7.8，10mmol/ L MgCl2，1mmol/L DTT），5μl DNA，2μl限制性酶(1-5μl/μg DNA)，用灭菌双蒸水补足至50μl，在振荡器上温和振荡几秒钟，然后稍稍离心(3 000r/mmin)数秒，以使管壁液体集中于管底，37℃恒温水浴中孵育1小时，65℃水浴作用10分钟，或用EDTA终止反应。

(3) 电泳依据酶切片段的大小选择不同浓度的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶作为支持物进行电泳，同时加入标准DNA作分子量参照物，经溴乙锭(EB)或硝酸银染色，在相应的光源下观察结果并拍摄记录电泳图谱。

以上为酶切反应操作的基本过程。如果进行多酶切反应，则要考虑反应缓冲液要基本适用于所用的各种酶。若两种以上的酶对缓冲液要求不同，如盐浓度要求不同时，先进行低盐要求的酶切反应，再进行高盐要求的反应，对反应温度要求不一的也是先进行低温度酶切，再进行高温度酶切。

2.酶切分析应用限制性核酸内切酶在分子生物学研究中占有极其重要的地位，几乎每一个研究领域都离不开限制性内切酶，其应用非常广泛，如病原微生物DNA分析；DNA序列分析，将庞大的DNA分子切割成小片段便于序列分析；DNA重组和组建新质粒；建立DNA的物理图谱等。

用限制性内切酶分析(Restriction EndonucleaseAnalysis REA)病原微生物DNA已成为一种常用的方法，通过酶切消化DNA，然后电泳染色呈现大小不一的片段，对这些片段的迁移率及数量进行分析，便可了解到病原微生物遗传物质的一定特性，在此基础上采用双酶切割或杂交等方法，则可推测出片段的排列顺序和酶切位点，从而推断出DNA间存在的相似性或差异性，对于动物病毒尤其是对疫苗毒、野毒及变异毒株的检测具有重要的意义。

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